研究要點

冷凍透射電子顯微鏡（cryo-TEM）能夠對水合狀態下的高分子進行亞納米分辨率成像，為精準解析其結構與在溶液中的演化過程提供了一種有力手段👱🏿。然而🌗，高分子材料的電子輻照損傷限製了其cryo-TEM成像的分辨率和質量🧑‍🤝‍🧑。這種損傷主要源於高能電子與高分子及其周圍玻璃化冰層相互作用產生的活性自由基。這些自由基會引發一系列化學反應，導致高分子結構的分解和破壞。自由基清除劑可以捕獲活性自由基並終止其鏈式反應，因此有望減輕電子輻照對高分子結構的破壞。其中，抗壞血酸是一種典型且高效的自由基清除劑👩‍🦲，能夠有效捕捉羥基自由基和其他活性氧自由基。目前，自由基清除劑作為樣品保護劑😏，已經在低溫X射線衍射、幹態TEM和液腔TEM等實驗中得到了成功應用，然而其在冷凍電鏡實驗中的有效性仍然缺乏研究❓。

基於此，本研究探索了抗壞血酸鈉（SA）作為自由基清除劑對高分子cryo-TEM成像效果的影響。研究發現，SA將膠原纖維的抗電子輻照能力提高了40%以上，同時對於纖維素和脫鐵鐵蛋白等富含羥基的高分子也有著類似的保護效果🧎，其效果顯著優於其它幾種自由基清除劑。通過單顆粒分析👩🏻‍🏭，研究人員發現脫鐵鐵蛋白在加入0.5 M SA後仍能保持完整的三維結構，顯示該方法有助於高分子的cryo-TEM成像分辨率和質量🗒。

圖文解讀

圖1.添加SA對於膠原纖維電子輻照耐受性的影響。

如圖1所示，在不添加SA時🙏🏿，膠原纖維對於電子輻照非常敏感，在當電子輻照劑量達到20 e^-/Ų時👲🏽，其微觀結構即遭到破壞🔵；而當劑量達到200 e^-/Ų時💢，嚴重的輻照損傷會使得膠原纖維周期性結構的界面處產生大量的氣泡。在添加0.1 M SA後，膠原纖維的結構更加穩定，同時氣泡的形成也得到了明顯抑製🎴🔮。快速傅裏葉變換（FFT）定量分析結果顯示，添加0.1 M SA可以使膠原纖維的細微結構能夠耐受104 e^-/Ų的輻照，同時產生氣泡的輻照劑量也增加到了280 e^-/Ų，比未添加SA的情況分別高出117%和43%。這些結果表明SA有效減輕了電子輻射對膠原纖維結構的損傷。研究人員發現6️⃣，SA對於同樣含有大量羥基的纖維素和脫鐵鐵蛋白也具有顯著的保護作用👎🏼，顯示了該方法的普適性💌；但對於缺乏羥基的樣品👋🏿，如脂質體，SA則並未體現出明顯的保護作用☺️。

圖2.膠原纖維在不同濃度的自由基清除劑作用下的cryo-TEM圖像。

研究人員對不同濃度的SA、NaCl、NaNO₃和甘油等自由基清除劑的效果進行了比較𓀁。結果表明，0.1 M SA對膠原纖維保護效果最佳，優於NaCl和NaNO₃，這和它們與羥基自由基的反應速率常數有關😷，如抗壞血酸根與羥基自由基的反應速率常數比氯離子高一個數量級，因此能夠更有效地清除自由基，進而保護膠原纖維的穩定性🐝。值得註意的是，使用過量的SA會降低其保護性能🧑‍🏭，這應該是由於大量的SA在電子輻照下會產生新的自由基。此外，研究人員發現甘油反而會降低膠原纖維的穩定性🪀🤵🏼‍♀️，這很可能是由於甘油自身的不耐輻照性。

圖3. 加入0.5 M SA後脫鐵鐵蛋白的單顆粒重構結果

為了驗證SA對高分子樣品精細結構的影響✋🏻，研究人員分別對不含SA和含0.5 M SA的脫鐵鐵蛋白進行了單顆粒采集實驗。結果顯示，加入SA後🙍🏽，脫鐵鐵蛋白的結構在電子輻照下更為穩定。三維重構結果顯示👨🏻‍🔬，加入SA後的脫鐵鐵蛋白分辨率（2.20 Å）略高於未加入SA的樣品（2.28 Å）👩🏽‍🚒，且未破壞其對稱結構，氨基酸殘基的局部密度與原子模型也仍舊能保持的匹配🐫。這些結果表明🐨，加入SA可以提高蛋白質精細結構在電子輻射下的穩定性，從而獲得更高分辨率的cryo-TEM結果。

總結與展望

該工作成功使用SA提高了高分子樣品在cryo-TEM實驗中的輻照穩定性，從而為獲取更高質量的cryo-TEM表征結果提供了一種有效的策略🔦。值得註意的是，在應用該方法後🙍‍♂️，高分子樣品精細結構的電子輻照耐受性仍只有約100 e^-/Ų，尚無法完全滿足高分辨cryo-TEM和冷凍電子斷層掃描（cryo-ET）實驗的需求。研究人員希望在未來的實驗中找到更加有效的樣品保護劑🤱🏼，從而進一步提升高分子樣品的輻照穩定性✴️。

本工作發表於《Macromolecules》期刊🪞，論文第一作者為沐鸣娱乐博士生張丕蘭😟，沐鸣开户為第一完成單位👉🏻，文章鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.macromol.4c02108